Methodik der Antigenidentifizierung

Wir verwenden ein von uns modifiziertes Verfahren des T-zellbasierten cDNA-Expressions-screenings, um die Zielantigene autologer und allogener antitumoraler T-Zellantworten (vorwiegend bei Melanomen und bei akuten myeloischen Leukämien) zu identifizieren. 
 
Tumor/Leukämie-reaktive T-Zellen werden in sog. autologen gemischten Lymphozyten/Tumorzell-Kulturen (MLTC) oder in allogenen gemischten Lymphozyten/Leukämiezell-Kulturen (allo-MLLC) stimuliert und dadurch expandiert und angereichert. Die MLTC/MLLC-Responderlymphozyten werden auf die Erkennung autologer Tumorzellen überprüft und schließlich in Aliquots kryokonserviert. Gelingt die Expansion Tumor/Leukämie-reaktiver CD8⁺ T-Zellen, werden die HLA-Klasse I-Allele des betreffenden Patienten kloniert. Unabhängig generierte CD8⁺ Responder-Lymphozyten-populationen werden in einem Paneltest auf Reaktivität gegen bereits bekannte Tumor/Leukämie-assoziierte Antigene überprüft. Dabei erwies sich der ELISPOT-Assay als essentiell für das Screening mit nicht-klonalen kryokonservierten T-Zellpopulationen. 
 
Aus eigenen Vorarbeiten und in einem Kooperationsprojekt mit dem Ludwig Institut für Krebsforschung in Brüssel (Prof. Pierre van der Bruggen) steht uns ein Panel von derzeit 31 cDNA-Klonen in Expressionsplasmiden zur Verfügung, die für bekannte, strukturell normale Antigene kodieren. Diese Panelantigene werden mit jedem der HLA I-Allele des jeweiligen Patienten in COS-7- oder 293T-Zellen transfiziert. Die Transfektanten werden dann im IFN-g-ELISPOT-Assay auf Erkennung durch MLTC/MLLC-Responder getestet. Dabei wird herausgefunden, ob in den MLTCs/MLLCs T-Zellen mit Reaktivität gegen eines oder mehrere der Panel-Antigene enthalten sind. Zum Teil werden dabei neue Peptide entdeckt, die aus den bekannten Proteinantigenen prozessiert und an der Zelloberfläche präsentiert werden. 
 
Mit MLTC/MLLC-Respondern oder aus ihnen abgeleiteten CTL-Klonen, die nicht bekannte Antigene erkennen, wird ein cDNA-Bank-Screening durchgeführt. Hierfür werden aus den Tumorzelllinien bzw. Leukämiezellen der untersuchten Patienten cDNA-Banken in geeigneten Expressions-plasmiden hergestellt. Jede Bank wird zunächst in Pools von je 100 cDNA-Klonen unterteilt (100xPools). Plasmide dieser Pools werden mit Plasmiden, die für restringierende HLA-Allele kodieren, bspw. in COS-7-Zellen transfiziert und die Transfektanten werden mit dem IFN-g-ELISPOT-Assay auf Erkennung durch T-Zellen getestet (CD8⁺ MLTC-Responder bzw. CTL-Klone). 100xPools, die INF-g-Spots induzieren, werden schrittweise kloniert. Antigenexprimierende cDNA-Klone werden sequenziert. Zum Vergleich werden homologe Sequenzen aus Datenbanken herangezogen sowie Sequenzen homologer cDNA aus nicht-malignen Zellen des jeweiligen Patienten. Weitere Schritte beinhalten die Eingrenzung der peptid-kodierenden Region bis hin zur Identifizierung des jeweiligen T-Zell-erkannten Peptids. 
 
Dieses Verfahren ermöglichte uns Analysen des antitumoralen T-Zell-repertoires in einer bislang nicht erreichten Komplexität und führte zu einer Beschleunigung und höheren Erfolgsquote. Es wird von uns für detaillierte Analysen des antitumoralen T-Zellrepertoires bei Melanompatienten (V. Lennerz et al., PNAS 102:16013, 2005) und für die Identifizierung von Kandidaten-Zielantigenen der Graft-versus-Host-Erkrankung und des Graft-versus-Leukämie-Effekts bei der allogenen Blutstammzelltransplantation (C. Wölfel et al., Cancer Immunol Immunother 57(6):849-57, 2008) eingesetzt. Dabei führt die T-Zell-basierte Expressionsklonierung zu eigenständigen Informationen, die von "T-Zell-freien" Antigenidentifizierungsverfahren bislang nicht abgedeckt sind. 
 
Gründe hierfür sind v. a.:

• die Sensitivität der T-Zellerkennung, die von effektorunabhängigen biochemischen Verfahren nicht erreicht wird, und
• die Fähigkeit zur Entdeckung genetisch alterierter Antigene, die effektorunabhängige Genom-, Transkriptom- bzw. Proteom-weite Screeningverfahren in ihrer derzeitigen Abhängigkeit von relativer Überexpression nicht erfassen.